徐州血液RT-PCR检测技术应用
Real-time PCR操作流程:1、收集样品。2相关试剂总RNA提取试剂TREzolReagent(RNA提取试剂),M-MLV(cDNA逆转录酶),RNA纯化试剂,RealqPCRMasterMix(萤光定量PCR预混试剂)。3实验仪器萤光定量PCR仪;PCR仪;低温离心机。4总RNA提取。5cDNA合成在0.5ml的离心管中加入1µl模板总RNA(1µg/µl);Real-time PCR操作流程:2µl随机引物(T18,10pmol/ul);2µl10mMdNTPmix;加水至15µl体系。混匀后70℃变性RNA5分钟,冰上速冷1分钟,离心将溶液收集至管底加入6µl5×PCRbuffer;1µlRNaseout;1µlM-MLVRT;加水至30µl体系。PCR仪中反应条件设定37℃延伸60min,70℃保温15min终止反应。合成好的cDNA置于-20℃保存备用。逆转录聚合酶链反应(逆转录-聚合酶链反应):用于从RNA中扩增DNA。徐州血液RT-PCR检测技术应用
Real-time PCR:基线(baseline):通常是3-15个循环的荧光信号,同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。阈值(threshold):自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。手动设置:置于指数扩增期,刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值,但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。Ct值:与起始浓度的对数成线性关系,分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。相对定量:通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因之间的表达差异,一般是2-△△Ct。或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。杭州分子生物学定量PCR哪家好热启动聚合酶链式反应:一种在PCR的初始建立阶段减少非特异性扩增的技术。
聚合酶链式反应的试验污染:PCR反应的很大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人脑袋不适的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因:标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。如果基因的基因组DNA序列是已知的,逆转录-聚合酶链反应可以用来绘制基因中外显子和内含子的位置。
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DN段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的很大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。到2013年,PCR已发展到第三代技术。聚合酶链式反应准备:引物内部不应出现互补序列。
Real-time PCR相对定量中的标准曲线法如何进行:主要是相对定量标准品的制作,一般有三种方法:1、比较复杂的方法:质粒,采用Biotnt提供内参基因的特异性Real-time PCRmRNA引物,对目的基因进行Real-time PCR实验,得到PCR扩增产物;PCR扩增产物转入质粒中,得到相对定量的标准品;2、一般采用的方法1:比较强的CDNA模板,3、一般采用的方法:PCR扩增产物,如果在方法2中找不到比较强的CDNA模板,则选用PCR产物作为相对定量的标准品也是可以的;需要注意的事项是:PCR产物浓度很高,而Real-time PCR的产物片段比较短,容易在稀释的过程中造成PCR污染,要注意操作。所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团。无锡骨头RT-PCR检测技术哪家好
基于探针的化学法,Real-time PCR应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物。徐州血液RT-PCR检测技术应用
PCR的反应条件:dNTP浓度过高会加快反应速度,但同时还可以增加碱基的错误掺入率。引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增。TaqDNA聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增,低则合成产物量减少。TaqDNA聚合酶无校正功能,掺入错误率达2*E-4个核苷酸,一个30个循环的扩增反应0.1%-0.25%总错误率。在90~95度下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95度30~60s。时间过长使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破坏增多。DNA很快冷却到40~60度使引物和模板结合。引物长度在15~25时退火温度。热启动/冷完成聚合酶链反应是通过新的杂合聚合酶实现的,这些酶在环境温度下不活跃。徐州血液RT-PCR检测技术应用
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