宁波骨头RT-PCR检测技术供应商
Real-time PCR的染料法和探针法的选择:进行mRNA表达量的测定,采用染料法是比较经济实惠的;染料法可以通过比较熔解曲线的熔解峰位置得到产物特异性的情况;目的基因和内参基因分管检测,染料法可以选用Realtime染料PCRPreMIX,探针法主要应用于病毒RNA的检测;以及单位点突变(SNP);多基因的合并检测,探针法还可用于同一个反应中同时检测目的基因和内参基因的情况;而染料法则必须分管检测。Real-time PCR:实时荧光定量PCR技术(Real-timequantitativePolymeraseChainReaction简称Real-time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,使每一个循环变得“可见”,之后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。聚合酶链反应是是一种简单,廉价和可靠的方法复制DN段。宁波骨头RT-PCR检测技术供应商
聚合酶链式反应准备:PCR引物设计,PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。引物设计的基本原则:引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC很好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。常州血液荧光定量PCR网站实时荧光定量PCR法较大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差。
Real-time PCR:使用Real-time PCR进行基因检测,被普遍应用于病毒和病原菌检测、转基因食品检测、遗传病基因检测等领域。一般首先需要利用专业使用的试剂盒从待检样品中提取其核酸(DNAorRNA),并经过精制等复杂的操作(通常称为前处理操作)之后才可以进行Real-time PCR。不易受反应阻害物的影响,使用时不需要进行复杂的前处理操作,单单需将待检样品直接加入到检测试剂中即可开始检测。通过使用本产品,可以在更短的时间内,简便、低成本地进行Real-time PCR检测。
实时荧光定量PCR:实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。因此,实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的:Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。实时荧光定量PCR实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度。
内标在传统定量中的作用,由于传统定量方法都是终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,而PCR经过对数期扩增到达平台期时,检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验,所得结果有很大差异,因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后,可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此,传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。内标对定量PCR的影响,若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为明显。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标,但仍然只是一种半定量的方法。Real-time PCR可看作是生物体外的特殊DNA复制。宁波骨头RT-PCR检测技术供应商
Real-time PCR技术即实时萤光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差。宁波骨头RT-PCR检测技术供应商
Real-time PCR原理:Real-time PCR主要指在PCR反应体系中加入荧光物质,然后通过荧光化学物质监测每次PCR反应循环后产物总量的方法,之后通过内参法或外参法对待测样品中的特定DNA序列(目的基因)进行定量分析的方法。实验过程中,这些荧光物质可以在激发光的作用下释放出一定波长的发射光,定量用PCR仪通过对这些发射光进行实时监测,较终可以描绘出整个PCR的反应过程,这就是Real-time PCR的原理。Real-time PCR链式反应:DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是,DNA聚合酶在高温时会失活。宁波骨头RT-PCR检测技术供应商
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