湖南胸水外泌体示踪

妊娠期间胎盘可释放外泌体到全身循环系统，参与妊娠期间母胎界面的免疫调节、子宫螺旋动脉重塑和胎盘屏障的形成等重要事件调控，在正常妊娠过程维持中发挥重要作用。而很多妊娠并发症，如子痫前期等胎盘功能紊乱相关疾病的发生，很可能与胎盘来源外泌体异常密切相关。目前外泌体分离方法主要包括：多步差速离心、蔗糖密度梯度离心、试剂盒沉淀、免疫磁珠分选、色谱法、过滤离心等方法。其中，多步差速离心是制备外泌体的经典方法，该方法是根据外泌体的沉降系数差速离心将其分离出来，然而妊娠期母血清中除含有胎盘组织释放的外泌体，还包括许多其他种类细胞释放的外泌体，如树突状细胞、淋巴细胞等，且血清中可能还存在一些大小类似的物质混杂其中，这些因素都会影响胎盘来源外泌体的分离纯化。干细胞外泌体具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成等功能。湖南胸水外泌体示踪

    在真核生物中，泛素-蛋白酶体系统(UPS)和自噬-溶酶体途径(ALP)对于维持细胞蛋白稳态至关重要并与CA进展相关。我们之前的研究表明，磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)是人类CA中醉常见的突变基因之一，它限制了蛋白酶体的丰度，并决定了胆管ai(CCA)中蛋白酶体抑制剂的化学敏感性。然而，PTEN是否调节溶酶体通路仍不清楚。我们在CCA细胞系中使用功能丧失和功能获得策略测试了PTEN对溶酶体生物发生和外泌体分泌的影响。使用体外去磷酸化测定，我们探索了PTEN与溶酶体生物发生的关键调节因子转录因子EB(TFEB)之间的调节机制。使用迁移试验、侵袭试验和经脾肝转移小鼠模型，我们评估了PTEN缺陷、TFEB介导的溶酶体生物发生和外泌体分泌对tumour转移的作用。此外，我们通过回顾性分析研究了PTEN表达和外泌体分泌的临床意义。PTEN通过其蛋白磷酸酶活性使TFEB在Ser211位点去磷酸化，从而促进溶酶体生物发生和酸化。值得注意的是，PTEN缺乏通过减少溶酶体介导的多泡体(MVB)降解来增加外泌体分泌，这进一步促进了CCA的增殖和侵袭。TFEB激动剂姜黄素类似物C1抑制了小鼠模型中PTEN缺陷引起的转移表型，我们强调了临床队列中PTEN缺陷与外泌体分泌之间的相关性。在CCA中。 江苏腹膜透析液外泌体染色PKH67/PKH26外泌体膜上富含参与外泌体运输的跨膜蛋白家族（CD63, CD81 和CD9）、热休克蛋白家族（HSP60, HSP70和HSP90）。

细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）是几乎所有类型细胞都能分泌的具有膜结构的一类微小囊泡，通过携带携带蛋白质、脂类、核酸等生物活性分子，在细胞间通讯中发挥多功能调节作用。非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）可以通过调节表观遗传、转录和转录后水平的基因表达来影响CA进展。有研究表明EV来源的非编码RNA具有高度的组织特异性和稳定性，因此可以成为有前途的诊断生物标志物。tumour转移是CA治疗失败和患者死亡的主要原因。越来越多的证据表明肿瘤细胞来源的EV通过传递非编码RNA影响“organ特异性转移”，驱使tumour扩散并定植到特定的靶organ，主要包括骨、肝、肺、脑和淋巴结等。

细胞外囊泡（EVs）因其生物相容性、大小适宜、体循环中保存时间长和低免疫原性等优势，在生物医学应用中得到了普遍的应用。研究发现EV比普通的细胞膜囊泡更有优势。EV的优势在于，由于其表面的跨膜蛋白（如MHC复合物）数量减少，它们的免疫原性低于其宿主细胞膜，具体的多少取决于它们的细胞来源。凋亡小体、微泡和外泌体是根据EV的生物成因进行分类的。当胞内体的膜向内萌发形成外泌体时，就产生多泡体（MVB）。当MVBs与质膜融合时，外泌体被释放到细胞外空间。一旦从细胞表面释放出来，外泌体能够与细胞外基质相互作用，或在微环境内外引发反应。将RNA和蛋白质引入外泌体，并将其定向到身体特定区域的方法仍在开发中。外泌体被认为是一种合适的药物传递系统，因为蛋白质和遗传物质都可以装载到其中。外泌体的复杂性，为疾病检测和监测提供了一个多指标的诊断窗口。

现阶段，在基于EV的液体活检和CA研究中，有几个难以解决的问题，限制了这一领域的发展。例如，如何将微弱的CA相关信号与正常人体生理的背景噪声区分开来，尤其是在CA早期？如何阐明TME对tumour发展的贡献，并进一步开发TME相关的诊断和诊治策略？通过开发选择性分离富集技术、全mian鉴定cTME-EVs，为解决上述问题提供了前所未有的机会。刘定斌教授所领导的团队开发的D-S pHLIP系统突破了从CA相关体液中选择性富集cTME-EVs的困境，为tumour标志物的发现和EV的溯源提供一种全新的平台。此外，通过在D-S pHLIP的N端修饰染料或药物，可用于tumour精细成像和TME靶向药物递送，具有巨大的临床应用价值。外泌体主要来源细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质。黑龙江细胞上清外泌体鉴定

外泌体天然的可以携带遗传到靶细胞中，从而在生物学和致病过程中诱导遗传修饰。湖南胸水外泌体示踪

研究采用蔗糖密度梯度离心联合2次PEG6000沉淀，极大地降低了外泌体的提取成本，且获得的外泌体不仅表达外泌体公认的标志蛋白分子，同时也表达胎盘特异性蛋白分子，证明通过这种方法获得的外泌体是胎盘来源外泌体。通过蔗糖密度梯度离心后得到的外泌体沉淀经蛋白质SDS-PAGE胶电泳，银染后可见各蛋白分子条带清晰可见，动态光散射分析粒径，结果显示获得的外泌体颗粒粒径大部分分布于28-91nm之间，与文献报道外泌体颗粒大小相一致。胎盘外泌体经过PKH67荧光染料染色后，与细胞共孵育，荧光显微镜下观察外泌体具备进入细胞的活性，进一步验证了我们应用此种改良的分离方法可有效的获得胎盘来源的外泌体。本研究通过蔗糖密度梯度离心联合2次PEG6000沉淀成功分离得到母体血清中胎盘来源外泌体，并从蛋白标志分子、电镜、粒径及分布、进入细胞活性四方面对其进行了鉴定，为研究妊娠期间胎盘外泌体在正常妊娠及胎盘源性并发症中的作用奠定了基础。湖南胸水外泌体示踪

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