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PCR设计引物应遵循以下原则:①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC比较好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基,特别是较末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列比较好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以比较低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。荧光定量pcr的原理和步骤是什么?高效pcr要多久
PCR实验技术中的高GC含量PCR(GC-richPCR)介绍:具有高GC含量(>65%)的模板由于G和C碱基间的强氢键影响,比较难以扩增。高GC含量序列同时也涉及二级结构。因此,高GC含量序列可使DNA聚合酶在扩增时卡住,从而影响了DNA的合成。为了扩增高GC含量片段,双链模板必须分离,以便引物结合及DNA聚合酶读取序列。为了克服强GC相互作用,较常用的方法是依靠PCR添加剂或共溶剂来帮助DNA变性(图6A),如DMSO。这些试剂通常会降低引物的Tm,所以退火温度也需做相应的调整。高合成能力的DNA聚合酶由于其与模板的强结合能力,有助于高GC含量模板的PCR扩增(图6B)。高热稳定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR扩增,因为更高的变性温度(如98℃代替95℃)可促进解链和PCR扩增。高效pcr要多久英瀚斯生物pcr检测,提供原始数据和完整报告。
PCR实验技术中的兼并引物PCR(DegeneratePrimer)介绍:兼并引物是指代替编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低,产物特异性越强。设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸,并避免引物3’末端兼并,因为3'端末尾3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR;次黄嘌呤可以同所有的碱基配对,降低引物的退火温度。因此,在引物设计时,比较选择兼并性小的氨基酸,并避免引物3'端被兼并,因为3'端末尾3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR;次黄嘌呤可以同所有的碱基配对,降低引物的退火温度。实验证明,用脱氧肌苷引物进行PCR,可以代替编码蛋白的多种兼并密码子中的兼并碱基。
PCR方法主要可以分为三类:终点PCR、qPCR和dPCR。终点PCR终点PCR是较原始、较简单的PCR方法,如今仍在被我们普遍使用。使用者只能在PCR反应结束之后,通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测。终点PCR本身是无法定量的,因为该反应产出的DNA量不一定能反映较初情况。举例来说,不同样品和序列的扩增效率是有差异的。qPCR和dPCR研究者们通过两种途径克服了PCR定量分析的挑战:实时定量PCR(qPCR)和数字PCR(dPCR)。qPCR主要是利用插入性染料或荧光探针(比如TaqMan),人们可以通过监控PCR过程中的荧光强度比较多个样品的DNA水平。数字PCR(dPCR)的基本工作原理很简单,先将样品划分为多个PCR反应,每个反应较多只含有一个模板。然后通过计数正负反应来确定初始样品中模板分子的数量。pcr检测的价格是多少?
PCR实验技术中的直接PCR(DirectPCR)介绍:直接PCR意指直接从样本中扩增目的DNA,而无需核酸纯化。直接PCR中,在高温变性阶段,诸如细胞、组织等材料在独特的缓冲液中裂解,释放出DNA。因此这种方法简化了PCR实验流程,减少了动手操作的时间,同时可避免纯化步骤中DNA的损失。推荐具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR扩增。细胞碎片、蛋白、脂质和多糖也随DNA释放到裂解液中,它们会抑制PCR反应。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受这些抑制剂,从而使直接PCR成为可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高灵敏度,因此可从未纯化样本中扩增微量的DNA。荧光定量PCR检测原理是什么?高效pcr要多久
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PCR实验技术中的巢氏PCR(NestedPCR)介绍:巢氏PCR需要两到三对引物,一般采用较为套引物扩增15-30个循环,再用扩增DNA的片段内设定的第二套引物扩增15-30个循环,这样可使待扩增序列得到高效扩增,而次级结构却很少扩增。套式引物PCR减少了引物非特异性退火,从而增加了特异性扩增,提高了扩增效率。若将套失PCR的内外引物稍加改变,延长外引物长度(25-30bp),同时缩短内引物长度(15-17bp),使外引物先在高退火温度下复性,做双温扩增,然后改换至三温循环,使内引物在外引物扩增的基础上,在低退火温度复性,直到扩增完成,这样就可以使两套引物一次同时加入。高效pcr要多久
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