SIRT7免疫荧光

荧光的猝灭：荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。免疫荧光技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域具有普遍应用。SIRT7免疫荧光

免疫荧光法是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位。MCP1免疫抗体使用荧光抗体方法是免疫荧光技术中常见的操作步骤。

免疫荧光注意事项：对照实验的设置：1、内源性组织背景对照：某些细胞和组织可能有固有的生物学性质，会产生背景荧光，对结果产生影响，例如色素脂褐质。因此在孵育一抗前，应对样品进行观察，确保抗原本身没有信号。2、阳性对照：用确认含有待测抗原的组织或细胞，与待测标本进行统一处理，结果应为阳性，可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。3、阴性对照：与阳性对照相反，用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。

免疫荧光通透（目的是使抗体进入胞内），0.5%TritonX-100(一种去垢剂，用PBS配制)室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了TritonX-100，也可作为通透剂，并且固定后的样品不需要通透。封闭（减少一抗和二抗与非特异位点进行结合），通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。荧光抗体法和荧光抗原法都属于免疫荧光技术的范畴。

细胞的固定及免疫荧光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔内滴加足够量适宜浓度的二抗，37℃，室温避光孵育1小时。注意二抗带有荧光素标记，因此操作过程尽量在暗处进行。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst复染细胞核，一般为蓝色荧光；避光孵育5-10min。使用PBS轻洗细胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧，张力较大，可将注射器针头针尖向背面做个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出即可。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，注意将爬片反过来贴于多聚赖氨酸载玻片上，然后在荧光显微镜下观察并采集图像，注意选择抗体对应的激发光源。免疫荧光技术可以用于研究疾病的发生机制和医治效果评估。MCP1免疫抗体

免疫荧光技术可以用于研究细胞内蛋白质的定位和表达水平。SIRT7免疫荧光

免疫荧光检测相对于酶检测的优势：定量荧光信号的能力（与使用基于酶的方法进行的定性测定相反）；复用能力（可以结合不同发射光谱的荧光染料来检测多种蛋白质）；荧光染料的光稳定性。免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。SIRT7免疫荧光

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