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CCK-8的原理

所以粗略的可以认为生成的甲瓒物的颜色的深浅与活细胞的数量成正比。为什么是粗略的呢，因为这里没有考虑到细胞代谢水平的高低，有些细胞在***处理后，可能活细胞数不变，但是代谢率低了以后，细胞呼吸减弱，NAD+产生减少，测出的Formazan也会减少，所以此时怎么算呢（此时我就比较怀恋中性红了）？当然也有解决的办法，下期给大家介绍。因此可利用这个原理进行细胞增殖和毒性分析，在吸光度为450时检测读数。用途及常用的公 CCK8虽好,这些情况下不建议用!北京cck8 dojindo 说明书

CellCountingKit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】。它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。湖北cck8 ic50使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂.

当使用标准96孔板时，贴壁细胞的**小接种量至少为1000 个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500 个/孔(100μl培养基)。酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

注意事项CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。当在培养箱内培养时，培养板**外一圈的孔**容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，**外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。

cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉**大值与**小值，其余取平均值。我用的是排***，会省很多力气，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液***和选用**适***头了。

能力有限，表达不清的大家凑合着看看吧。有疑问的欢迎大家留言讨论，我们的目标是共同进步，哈哈。 灵敏度高，数据可靠，重现性好.

用途：

***筛选、

细胞增殖测定、

细胞毒性测定、

**药敏试验等。

所需设备及仪器：

10ul，100-200ul及多通道移液器

酶标仪（带有450nm滤光片）

96孔培养板

二氧化碳培养箱

培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认比较好条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。 若细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 发生变化，建议更换培养基后再加 CCK-8.北京cck8测毒性实验时间过长会怎样

CCK8原理、优势和步骤.北京cck8 dojindo 说明书

在细胞培养箱内继续孵育1-4小时，对于大多数情况孵育2小时左右就可以了。6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度（使用酶标仪之前要提前开启10min预热）测定完成后，保存数据。7.连续五天检测，每天保持一样的时间点加入CCK-8溶液，在培养箱内孵育时间相同。注：若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉***影响。当然***影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入***后的空白吸收即可。北京cck8 dojindo 说明书